HRM技術在植物育種中的應用

    HRM(High Resolution Melting，高分辨率溶解曲線)，作為(wei) 上成熟的點突變掃描與(yu) 檢測技術，在人類疾病相關(guan) 基因鑒定、植物誘變育種基因突變檢測及基因分型等多個(ge) 領域都得到了廣泛的應用。現在我們(men) 就重點關(guan) 注一下HRM技術在植物育種中的具體(ti) 應用。

    現代農(nong) 業(ye) 技術領域中，分子遺傳(chuan) 育種在植物育種中發揮著越來越大的作用。HRM之所以作為(wei) 分子育種中常用的突變檢測、基因分型技術，是由於(yu) HRM不受突變堿基位點和種類的局限，無需使用序列特異性探針，具有高靈敏度、操作簡單、高通量、成本低等優(you) 點。

HRM在植物誘變群體(ti) 中的突變掃描

    為(wei) 了獲得種質資源，常采用物理誘變、化學誘變等技術處理植物樣本，而這些誘變技術通常會(hui) 導致點突變、小片段插入缺失突變等。在獲得誘變群體(ti) 後，針對特定基因設計特異性引物，采用HRM技術高通量篩選誘變群體(ti) ，獲得突變個(ge) 體(ti) 。由於(yu) HRM技術速度快、成本低、通量高，所以非常適合植物誘變群體(ti) 的點突變掃描。

    在異源六倍體(ti) 小麥中，Dong等*次應用HRM分析EMS(Ethylmethane Sulfonate，甲基磺酸乙酯)誘發的點突變群體(ti) ，實現同時掃描小麥SSII-A、SSII-B和SSII-D。他們(men) 在SSII-A、SSII-B和SSII-D的C末端保守區域上相似性很高的一段序列(532bp含17個(ge) SNPs)設計引物，分幾個(ge) 片段(長度約100～250bp)可同時擴增三個(ge) 基因，然後對小麥農(nong) 家種Ventura的EMS誘變群體(ti) 進行HRM分析。對140個(ge) 樣品的未知突變進行掃描，片段ABD6-1由於(yu) 其G+C含量高(63.72%)、固有的SNP較多(5 SNIPs)及二級結構造成的影響，有15個(ge) 樣品出現差異的熔解峰，結合其他手段進一步證實該群體(ti) 擴增出的ABD6-1片段有8個(ge) 突變體(ti) ，而HRM分析掃描出其中的7個(ge) ；片段ABD2-9中有6個(ge) 突變體(ti) 而HRM掃描出其中的5個(ge) ；片段ABD12-22包含的6個(ge) 突變體(ti) 均被HRM掃描出。可見，HRM掃描未知突變的靈敏度較高(83.3%～100%)，且常受到G+C含量、二級結構、DNA樣品純度等因素的影響。

HRM在基因分型中的應用

    目前主流高通量SNP基因分型方法包括SNP芯片分型技術、KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）競爭(zheng) 性等位基因特異性PCR技術等，特別適合於(yu) 需要篩選多個(ge) SNP位點且群體(ti) 量大的樣本群體(ti) 。除此之外，HRM分析應該是僅(jin) 次於(yu) 以上兩(liang) 種高通量篩選技術的*選擇。HRM分析應用於(yu) 植物基因分型，不需要特異性序列探針，在PCR反應後直接對DNA雙鏈逐漸升溫變性熔解，然後通過光學檢測係統采集熒光信號變化並繪製溶解曲線，軟件會(hui) 根據曲線準確將野生型、雜合型、純合型樣本區分開來。（如圖）

      HRM實驗的成功，除了周密的實驗設計外，一款合適的儀(yi) 器也是獲得準確實驗數據*的保證。根據HRM實驗原理，對於(yu) 儀(yi) 器來講，的溫度均一性和高數據采集密度是保障實驗成功的核心所在。由於(yu) 點突變引起的解鏈溫度差異很小，一般要求儀(yi) 器的溫度均一性小於(yu) 0.2度才能檢測出突變引起的溫度差異，所以儀(yi) 器的溫度均一性越好，儀(yi) 器的檢測靈敏度就會(hui) 越高。此外，儀(yi) 器需要具備高的數據采集密度，才能實時地記錄整個(ge) 過程的溫度變化。

    瑞士Roche LightCycler 480Ⅱ推出的實時熒光定量PCR係統，以其的性能深受廣大科研工作者的青睞。對於(yu) HRM實驗，LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR係統除了具備以上兩(liang) 點要求外，zui大的優(you) 點在於(yu) 速度非常快且操作簡便，專(zhuan) 業(ye) 的軟件分析功能更有助於(yu) 突變個(ge) 體(ti) 的鑒別，支持一鍵數據導出，方便實用，是實驗室HRM實驗的*選擇！