酶切出現問題，先看內(nei) 切酶說明書(shu) ，相應試劑公司目錄。不同公司出產(chan) 的內(nei) 切酶，菌株來源、製備工藝、純度活力、酶切活性優(you) 化可能不同，酶切效果也有差別。可在上麵找到酶單位定義(yi) 、保存條件、酶切體(ti) 係[buffer及與(yu) 其它酶雙切的buffer等]、酶切反應溫度[有些酶是在50、55或30等溫度下反應的]、酶是否受甲基化影響、是否有星號活性及出現星號活性可能因素、保護性堿基，同尾酶、同裂酶等等。
1. 酶切不開或不*
1.1 質粒問題：純度差或殘留酶切抑製物zui為(wei) 常見。雜蛋白存在會(hui) 影響酶切，表現為(wei) A260/A280低於(yu) 1.8；抑製物常見酚、鹽、乙醇等。[重新提DNA，使用可靠試劑盒或可靠手工提取試劑]
1.2 酶的問題：確認內(nei) 切酶有效 [很多內(nei) 切酶雖然有過期時間，但過期後隻要能夠有效酶切，可用。確認酶切效果不好，做標記，更換] 。
【題外話：用內(nei) 切酶注意】
a. 內(nei) 切酶如無特殊要求，保存-20~-30度。並非越低越好，酶通常是保存在50％甘油緩衝(chong) 液中，溫度過低時，酶會(hui) 發生凍結（運輸過程例外，由於(yu) 酶需要低溫運輸，所以方便的情況下是使用幹冰，酶會(hui) 凍結，但凍結次數有限，相對是一種比較好的選擇），如果是經常使用的話，酶會(hui) 被反複凍融，從(cong) 而降低了活性。當然如果溫度過高，嗬嗬，你就自己想去吧。
b. 酶在使用時應置於(yu) 冰盒中取酶。這點大家都清楚，不過多強調也沒壞處。因為(wei) 實驗室有些同學，酶取出後是放在冰盒上的，但有兩(liang) 點忽略了：拿酶的時候，手不是抓著管子上端，而握在管子的底部，相當於(yu) 用手在給酶進行加熱；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的時候，還是將酶拿出來。偶爾一次沒有大礙，反複如此，可能會(hui) 影響酶活。
c. 酶使用完後應盡快旋緊蓋子。有時我們(men) 可以發現，即使是-20~-30度放置，酶仍然會(hui) 凍結。個(ge) 人認為(wei) 的可能原因是由於(yu) 在配置酶切反應時，酶管的蓋子在較長時間的開著，甘油會(hui) 吸取空氣中的水分，對於(yu) 常用的大包裝的酶有時就會(hui) 出現凍結現象。此外，有時由於(yu) 操作不小心，冰盒上凝結的一些碎冰掉在酶管裏了（我自己出現過兩(liang) 次，汗....）
d. 吸取酶時的tips。我們(men) 常用來取酶的tips都是zui小的那種，適合2ul和10ul的槍，但tips通常有兩(liang) 種，一種是zui常用的短的tips，用它取酶時，tips挨著酶液後，槍幾乎是要插入管子，有時會(hui) 在槍身上沾上酶液。因此，可能會(hui) 產(chan) 生汙染。那麽(me) 我們(men) 必要非常注意動作，要麽(me) 就換用另一種長的 tips，專(zhuan) 門取酶液用。
1.3 buffer問題。有些酶切的buffer中，添加了一些較為(wei) 容易析出或溶解的成分[連接酶的buffer更是這樣]，有時酶切的buffer沒有*融化時，buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分，鹽離子濃度要高，使用一段時間後，融化部分的離子濃度會(hui) 變低。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對離子濃度敏感的內(nei) 切酶時就會(hui) 出現問題。
1.4 雙酶切的buffer選擇：確認使用的是正確的buffer和反應溫度[具體(ti) 可以參考各廠家提供的酶切buffer以及雙酶切buffer的資料，其中，NEB的可以參見
https://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm
1.5 酶切位點的甲基化影響：有時甲基化會(hui) 影響酶切，常見的有Xba I、Bcl I 等。甲基化主要分為(wei) Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的質粒，質粒就會(hui) 因大腸杆菌的Dam、Dcm被甲基化；如果是直接從(cong) 哺乳動物細胞中提取的DNA，則部分DNA就會(hui) 因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點被甲基化後，酶切會(hui) 受影響。因此，出現酶切不開或不全時需要考慮甲基化的問題。甲基化通常出現在特定序列，以Xba I為(wei) 例，僅(jin) 當序列位5'-【TCTAGA】TC-3'時，Xba I的位點才會(hui) 被甲基化，並非所有的Xba I位點都會(hui) 出現甲基化。
具體(ti) 的列表可以參考
https://www.biocolors.com.cn/en/gsxw_p.asp?N_id=12
https://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C0007
https://www.neb-china.com/cn/tech/re/alteration.htm
其中，克隆常用的酶切位點見下表：
Restriction Enzyme Methylation
Sequence &Site Methylation Type Enzyme Activity Blocked?
AarI 5'...CACCTG cG...3' C partially
ApaI 5'...GGGCC cG...3' C partially
ApaI 5'...GGGCCc WGG...3' D partially
BclI 5-TGaTCA...3' A Compley
BglI 5'...GCC（N）5GG cG...3' C partially
BglI 5'...GCc WGGNNGGC...3' D Compley
Esp3I 5'...CGTCTC...3' E Compley
HincII 5'...GTYRA cG...3' C partially
HinfI 5'...GANT cG...3' C partially
HpaII 5'...CCGG...3' E Compley
HphI 5'...GGTGa TC...3' B Compley
MboI 5'...GaTC...3' A Compley
NheI 5'...GCTAG cG...3' C partially
NmuCI 5'...GTCA cG...3' C partially
NotI 5'...GCGGCCGC...3' E Compley
PvuI 5'...CGATCG...3' E Compley
RsaI 5'...GTA cG...3' C partially
SalI 5'...GTCGAC...3' E Compley
SatI 5'...G cG GC...3' C Compley
SmaI 5'...CCCGGG...3' E Compley
XbaI 5'...TCTAGa TC...3' B Compley
XhoI 5'...CTCGAG...3' E partially
Type A: a - N6-methyladenine （m6A）
Type B: a - N6-methyladenine （m6A）, Partially Overlap Dam Methylase Site GATC
Type C: c - 5-methylcytosine （m5C），Overlap CG
Type D: c - 5-methylcytosine （m5C） ，Partially Overlap Dcm Methylase Site CCWGG
Type E: m5CG or m5CNG（這種修飾主要發生在植物和動物來源的DNA）
1.6 酶切體(ti) 係問題：通常較大的反應體(ti) 係（>=50ul），較少量的質粒（<=1ug,或更少），酶切的會(hui) 更加*一些。
1.7 酶切或雙酶切時，保護性堿基及近末端位點堿基個(ge) 數的問題。在酶切PCR產(chan) 物時，酶切位點旁的堿基個(ge) 數可能會(hui) 影響酶切效率。同樣，在雙酶切載體(ti) 時，如果兩(liang) 個(ge) 載體(ti) 相鄰過近，也有可能會(hui) 影響酶切效果。這個(ge) 問題以前也曾有討論，具體(ti) 可以參考
https://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8577107&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#8577107
關(guan) 於(yu) 相關(guan) 的資料可以參見：
https://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm [針對PCR產(chan) 物酶切位點保護性堿基的資料]
https://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_vector.htm [針對載體(ti) 酶切位點近末端位點堿基個(ge) 數對酶切影響的資料]
2. 質粒酶切時出現smear。
2.1 體(ti) 係中的內(nei) 切酶含量過高：通常酶切體(ti) 係中的內(nei) 切酶含量不宜超過酶切體(ti) 係的10％，不管是單一酶切還是雙酶切，酶的含量在5％以下是比較合適的。由於(yu) 酶是保存在50％甘油緩衝(chong) 液中，過高的酶用量會(hui) 導致甘油含量提高，而從(cong) 引起酶的星活性；
2.2 酶切反應過程中有導致星活性的因素：有些內(nei) 切酶除了對甘油濃度外，對離子濃度、反應溫度、酶含量、反應時間等都可能產(chan) 生星活性。所以在使用內(nei) 切酶時，一定要留意說明書(shu) 中的描述，避免可能出現星活性情況的發生。減少酶用量、合適的反應溫度、不進行長時間的酶切反應，可減少星活性的出現。
2.3 酶切體(ti) 係可能汙染了其它物質：如其它的DNA、其它的內(nei) 切酶或DNA酶等。
參考貼：
限製性內(nei) 切酶的熱失活：https://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893410&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893410
內(nei) 切酶星號活性：https://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893487&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893487
限製性內(nei) 切酶保護堿基：https://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893511&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893511
進37度之前，用vortex或移液槍混一下更好，能把壁上的液體(ti) 旋掉!
但注意槍頭不要盡量沾帶上溶液，減少體係損失！
限製性內切酶的熱失活
熱失活是終止酶切反應的一種簡便易行的方法。大多數zui適反應溫度是37℃的酶在65℃下溫育20分鍾即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如將溫度升高至80℃，溫育20分鍾也可失活。下表注明了每種酶的失活條件。
在50μl的反應體係中，37℃條件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作為底物，加入5-10μl內切酶及相應緩衝液，反應60分鍾，然後升溫至65℃或 80℃溫育20分鍾進行熱失活。在上述混合液中加入0.5μg底物DNA（通常為λDNA），調節溫度至zui適反應溫度，溫育60分鍾。若瓊脂糖電泳顯示底物部分或*被消化，則表明該酶沒有*被熱失活。
內切酶星號活性
在非理想的條件下，內切酶切割與識別位點相似但不*相同的序列，這一現象稱星號活性。有人提出，這種"星號"活性可能是內切酶的一種普遍特性（1），如果提供給相應反應條件，所有內切酶都會出現非特異性切割。NEB已證實下列酶存在星號活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。
酶識別特異性的改變受酶本身的性質及可能引起星號活性的反應條件影響。常見的引起酶識別改變的條件有：單堿基替換、識別序列外側堿基縮短以及單鏈切刻（10）。Polisky等（4）對EcoR I的早期研究表明，在低鹽濃度、高pH值條件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；zui近，Gardner等（11）的研究表明，隻要識別中心的四堿基序列（AATT）不出現A/T替換，EcoR I可以切割其它任何單堿基替代序列。
大多數星號活性是可以控製的，做酶切反應時一般不考慮這方麵的因素。隻要在正常條件下，使用隨酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不會出現星號活性。下麵列出了導致或抑製星號活性的因素。
導致星號活性的因素：
1. 較高的甘油濃度（>5% v/v）；
2. 酶與底物DNA比例過高（不同的酶情況不同，通常為>100 U/µg）；
3. 低鹽濃度（<25 mM）
4. 高pH值（>pH 8.0）
5. 存在有機溶劑（如DMSO、乙醇（9）、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane（12）等）
6. 用其他二價離子替代鎂離子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）
以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I對甘油濃度更敏感，而後者則對高pH值更敏感一些（2）。
抑製星號活性的方法：
1. 盡量用較少的酶進行*消化反應。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。
2. 盡量避免有機溶劑（如製備DNA時引入的乙醇）的汙染。
3. 將離子濃度提高到100-150 mM（若酶活性不受離子強度影響）。
限製性內切酶保護堿基（不太懂）:
限製性內切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據識別位點兩邊的若幹個堿基，這些堿基對內切酶穩定的結合到DNA雙鏈並發揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護堿基。保護堿基常見於PCR引物設計時，為保護5` 端外加的內切酶識別位點，使酶切*而添加。其次，在分子克隆時，選擇載體的酶切位點也會碰到，相臨的2個酶切位點往往不能同時使用，因為一個位點切割後留下的堿基過少以至於影響旁邊的酶切位點切割。
保護堿基的具體設計可以可以看圖:
我有點不明白，上圖是檢測內切酶在切割不同寡核苷酸時的效率數據，怎麽能作為保護堿基的設計用呢？我設計引物是隨機設計保護堿基也切得很好呀？望樓主及戰友們賜教
的確，上圖是檢測內切酶在切割不同寡核苷酸時的效率數據，數據不僅考慮到末端堿基數量的影響，同時還考慮到了末端堿基組成對酶切效率的影響，*存在推敲的是，這些數據是使用“寡核苷酸”進行實驗的數據。
也就是說，保護性堿基的設計，除了要考慮“堿基個數”外，“堿基組成”也是要考慮的。當然，我們大多數戰友，包括我自己，考慮zui多的是“堿基個數”，對“堿基組成”的考慮通常是采用隨機，或兼顧引物Tm及GC％上。
因此，隻考慮“堿基個數”是比較省事的選擇，且似乎還沒有出現問題，至少我的實驗還沒有出現因為“堿基組成”不當而影響酶切的事情。
下表是引自TAKARA的，我個人覺得應該適合NEB、MBI、PROMEGA等其它的酶，它給出的結果僅考慮了“堿基個數”，對我們可能有幫助。
我做了一次酶切,雖然有目的條帶（載體和目的基因,目的基因不是很明顯,相反在其下方的條帶更明顯）,也就是說有雜帶,請問這結果的肯能原因.
我的菌株是從其他老師那裏得來的,提取出來的質粒好象比理想的要大（理想4000左右,跑出來的比5000大）.雙酶切質粒載體很明顯（pUC2700左右）,就是目的基因1400位置比較模糊（還是有）,900左右位置卻更明顯,而且下方還有雜帶. 按道理不應該酶把目的基因切斷. 請問可能的原因有哪些啊,怎麽改進啊.謝謝了.
1. “理想4000左右,跑出來的比5000大” —— 質粒是否經過單酶切處理？如果隻是簡單的將質粒進行電泳，數據是不具有參考意義的。
2. “目的基因1400位置比較模糊（還是有）,900左右位置卻更明顯,而且下方還有雜帶. 按道理不應該酶把目的基因切斷.” —— 仔細分析一下酶切位點，確認除了外源片斷兩端外沒有其它的內部切點。
附圖，這樣可以更好的討論問題。
需要去掉質粒上eGFP後的中止子,用於融合表達,方法是:在eGFP片斷的上下遊分別設計引物做pcr後連接,上遊加BamH1的酶切位點,下遊加Bgl2的酶切位點（同質粒上的酶切位點,不能改）.
pcr沒有問題,連接也有菌落長的很好,但是挑了40多個克隆,都是自連的,（我沒有用堿性磷酸酶磷酸化質粒）.BamH1和Bgl2的粘性末端是一樣的,但是pcr都沒有,所以考慮是自連.
其他因素排除後,我覺得可能是引物合成出錯導致pcr產物不能酶切,就又在另一個公司合成了引物,但是重新做的連接,挑了10個菌做pcr還是陰性.
我現在懷疑是不是引物設計的問題了,我在酶切位點前麵加的保護性堿基會不會影響酶切的效率.請高手幫忙看一下我的引物,謝謝
上遊: ATT GGATCC GGA TCT GCG ATC GCT CC
下遊: ATA AGATCT ACT ACT GCT TCC GTA CAG CTC GTC CAT GC（由於融合表達,加了幾個弱性aa）
限製性內切酶酶切注意事項
在進行限製性酶切反應過程中，影響限製性酶切反應效果的因素較多，要設計酶切反應，一般均應考慮諸如酶切係統、溫度條件、反應體積、底物性質及星型反應等因素。根據各種不同的
條件，酶切反應的設計一般應注意以下問題：
1. 大多數限製酶貯存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結冰。當zui終反應液中甘油濃度大於12％時，某些限製酶的識別特異性降低，從而產生星活性，更高濃度的甘油會抑製酶活
性。因此加入反應的酶體積不超過反應總體積的1/10，避免限製酶活性受到甘油的影響。
2. 濃縮的限製酶可在使用前用1×限製酶緩衝液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶失活，用水稀釋的酶不能長期保存。
3. 反應體係中Mg2+是限製酶僅有的共同因子，當用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時，酶活性會被抑製，或改變酶的特異性，導致星型反應。
4. 多種因素可引發星型反應：①非zui適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大於25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機溶劑的存在。
5. 反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑製酶的擴散，並降低酶活性。建議酶切反應的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。
6. 酶切反應所加入的酶量應適中，根據底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對不同的限製酶，各廠家均有一zui大的消化量指標可參考。
7. 當要用兩種或兩種以上限製酶切割DNA時，如果這些酶可以在同種緩衝液中作用良好，則兩種酶可同時切割，如果這些酶所要求的緩衝液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：
①先用在低離子強度的緩衝液中活性高的酶切割DNA，然後加入適量NaCl及第二種酶，繼續反應；
②使用能夠使多數內切酶均表現較高活性的單種緩衝液。
8. 用同一種酶切割不同的DNA時，所需酶量不同，可根據DNA底物上酶切位點的多少與λDNA存在位點的數目比較後，決定用酶量。對於超螺旋DNA，基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA，使用的酶單位活性應適當加大。
9. 反應混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩定性。
10.酶切底物DNA應具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、 yi mi，大於10mM的EDTA，去汙劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限製酶的活性。
11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個重要因素，所以轉化實驗所選擇的受體菌株應考慮到使用的菌株中的酶修飾係統。
12.要保證酶作用時的*反應條件（ph, 溫度）和底物用量，酶反應才能有效地進行。
13.反應取酶時應使用無菌吸頭，以免汙染酶液，同時應盡量縮短酶在溫室的放置時間。
14.高於37℃或需長時間保溫時，可加入礦物油覆蓋在反應液上以減少水分蒸發。
15.反應混合物混勻時，應避免強烈振蕩以保證不使內切酶變性及DNA大分子的完整。
16.反應前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附於管壁上的液滴全部沉至管底。
17.用已矽化的離心管進行酶切反應，可獲得更佳的酶切效果，否則DNA可能粘附於管壁而影響酶切效果。
18.終止酶反應可根據需要采用不同的方法：①酶切後不需進行下一步反應，可加入含EDTA的終止液終止反應；②若需進一步反應（如連接，切割等），可將反應管置65℃保溫20-30分鍾，以滅活酶終止反應。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉澱獲得較純DNA進行下一步酶學操作。
19. 不同廠家的試劑不可混用，需要時請查明相關條件及數據。
二、限製性酶解中常見的問題及解決措施：
限製性酶切割DNA底物的操作過程中，會出現一些問題，產生的原因主要為酶解體係中各要素處於非*狀態，包括DNA的純度和特性，反應緩衝液、反應體積、反應時間及溫度等。
問題
原因
解決辦法
DNA*沒有被內切酶切割
1） 內切酶失活。用標準底物檢測酶活性
2） DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內切酶抑製因子。將DNA過柱純化，乙醇沉澱DNA
3） 條件不適（試劑、溫度）。檢查反應係統是否*？
4） DNA酶切位點上的堿基被甲基化。換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質粒DNA轉化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株
5） DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I）。換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I），重新將質粒轉至dcm+ dam+菌株中擴增
6） DNA位點上存在其它修飾。將DNA底物與λDNA混勻進行切割驗證
7） DNA不存在該酶識別順序。換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證
DNA切割不*
1） 內切酶活性下降。用5-10倍量過量消化
2） 內切酶稀釋不正確。用酶貯藏液或反應緩衝液稀釋酶
3） DNA不純，反應條件不佳。同上
4） 內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾。同上
5） 部分DNA溶液粘在管壁上。反應前離心數秒
6） 內切酶溶液粘度大，取樣不準。將內切酶稀釋，增大取樣體積
7） 酶切後DNA粘末端退火。電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鍾，取出後置冰浴驟冷
8） 由於反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性。使用標準反應緩衝液及溫度，避免強烈振蕩
9） 過度稀釋使酶活性降低。適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏
10）反應條件不適。使用*反應體係
11）識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序。加大酶量5-10倍
DNA PIAN段數目多於理倫值
1） 內切酶星狀活性
檢查反應條件：甘油濃度大於12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均可導致星狀活性，降低酶的用量
2） 其它內切酶汙染
用λDNA作底物檢查酶切結果
3） 底物中含其它DNA雜質
電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA pian段
酶切後沒有觀察到DNA pian段的存在
1） DNA定量錯誤（如RNA含量較高）
用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提後沉澱溶解，定量
2） 在酶切反應液中形成非特異的沉澱
在反應前透析DNA樣品或用酒精沉澱二次
內切酶保存期內快速失活
1） 保存溫度不合適
內切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在-20℃低溫保存
2） 以稀釋形式保存
稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用
3） 貯藏緩衝液不適當
使用廠家推薦的貯藏緩衝液
4） 低蛋白濃度
內切酶與500ug/ml的BSA一起保存
電泳後DNA PIAN段的帶型彌散，不均一
1） DNA上結合有蛋白質
電泳前上樣液65℃加熱5min，並加入0.1%的SDS，酚/lv fang抽提純化
2） 內切酶中含有DNA外切酶
減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶
酶切後的DNA pian段連接效率低
1） 含磷酸鹽的濃度高
透析，乙醇沉澱去除磷酸鹽
2） 內切酶失活不全或含有ATP酶
延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉澱回收DNA
3） 平末端連接
加大T4 DNA Ligase用量
4） 外切酶汙染
減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA
5） 連接緩衝液不合適
重新配製
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